Tumor hypoxie bepalen in het bloed via uitgescheiden membraanblaasjes.

Achtergrond en probleemstelling
In solide tumoren is er vaak een tekort aan zuurstof, ook wel hypoxie genoemd. Vaak leidt hypoxie tot een agressiever verloop van de ziekte, mede doordat behandeling minder effectief verloopt. Aanvullende therapie om dit tegen te gaan is beschikbaar, maar wordt klinisch weinig toegepast omdat alleen patiënten met veel hypoxie in de tumor hier baat bij hebben. Het kunnen bepalen van de mate van hypoxie in de tumor alvorens het starten met een behandeling, zou dus enorm waardevol kunnen zijn om de beste behandeling te selecteren. Helaas zijn methoden om dit ook daadwerkelijk te kunnen doen, niet gemakkelijk voorhanden. Bestaande methoden zijn vaak invasief, duur, niet gevoelig of niet specifiek genoeg. Daarom zijn alternatieve, klinisch toepasbare methoden, hard nodig.

Onderzoeksrichting / voorgestelde oplossing
In dit project willen we onderzoeken of door cellen uitgescheiden membraanblaasjes, genaamd ‘extracellular vesicles’ of EVs, kunnen dienen als indicator voor de mate van hypoxie in de tumor. Deze blaasjes worden uitgescheiden door alle lichaamscellen, ook door tumorcellen. Er zijn aanwijzingen dat de blaasjes de cellen waar ze vandaan komen weerspiegelen en als zodanig zijn ze in opkomst als het gaat om nieuwe biomarkers voor kanker.

Hier stellen we voor de hypoxische tumorcellen metabool te labelen met een stof genaamd pimonidazole. Pimonidazole wordt opgenomen door cellen, maar wordt alleen in de cel gebonden als deze zich in hypoxische condities bevindt. De pimonidazole verbindingen kunnen vervolgens worden aangetoond. Deze strategie kan bijvoorbeeld gebruikt worden om in afgenomen tumorweefsel hypoxie aan te tonen. Onze veronderstelling is dat pimonidazole gelabelde cellen, membraanblaasjes uitscheiden die ook gelabeld zijn. Deze zouden we kunnen isoleren en zo op een minimaal invasieve manier hypoxie in de tumor vaststellen. Preliminaire data laten zien dat hypoxische tumorcellen na labelen met pimonidazole inderdaad membraanblaasjes uitscheiden die ook gelabeld zijn. Het toepassen van dit concept in vivo, waar membraanblaasjes afkomstig van de tumor vermengd zijn met blaasjes van gezonde cellen, vergt echter verdere analyse. Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van de voorgestelde oplossing. 

Relevantie
Met dit onderzoek willen wij bijdragen aan de missie van KWF om betere behandeling van kanker te stimuleren. Met het ontwikkelen van een methode waarmee tumor hypoxie voor, maar ook tijdens de behandeling gemeten kan worden, kan een beter passende behandeling gekozen worden. Op die manier kan de effectiviteit van bestaande behandelingen verbeteren.

Onderzoeksvragen
In dit project, willen we de volgende onderzoeksvragen beantwoorden:

• Zijn membraanblaasjes gelabeld met pimonidazole primair afkomstig van de tumor of kunnen gezonde weefsels ook gelabelde blaasjes uitscheiden?
• Kunnen we dit meten door individuele membraanblaasjes tegelijk te analyseren voor pimonidazole en tumor markers?
• Hoe heterogeen zijn de membraanblaasjes op individueel niveau?
• Kunnen we gelabelde blaasjes linken aan de hoeveelheid hypoxie in de tumor?

Onderzoeksopzet
Om deze onderzoeksvragen te beantwoorden, willen een methode optimaliseren om individuele membraanblaasjes te analyseren. Deze methode zullen we baseren op microscopische analyse. We willen bepalen of dit geschikt is voor het analyseren van pimonidazole simultaan met tumormarkers. Vervolgens willen met deze procedure twee sets van samples analyseren:
1. materiaal dat we binnen dit project willen verkrijgen middels een diermodel.
2. materiaal afkomstig van patiënten dat we al beschikbaar hebben.

Voor het diermodel, willen we speciale tumorcellen laten groeien in muizen. Deze tumorcellen zijn zo gemodificeerd dat de membraanblaasjes die ze uitscheiden een fluorescent label bevatten. Op deze manier kunnen we de tumorblaasjes onderscheiden van blaasjes van gezonde cellen in het lichaam. Muizen zullen pimonidazole toegediend krijgen, waarna bloedplasma afgenomen zal worden. De membraanblaasjes zullen geïsoleerd worden om ze vervolgens te analyseren met de eerder geoptimaliseerde methode. Pimonidazole-labelling zal worden vergeleken met de aanwezigheid van het fluorescente label om zo te kunnen bepalen welke blaasjes positief zijn voor pimonidazole en of deze van tumorcellen afkomstig zijn. Van de tumoren zal ook bepaald worden wat de hoeveelheid hypoxie is, om zo vast te stellen of dit correspondeert met wat gemeten wordt in de blaasjes. Muizen zonder tumor zullen gebruikt worden als controles.

Daarnaast hebben we ook materiaal beschikbaar van patiënten met kanker die eenmalig pimonidazole hebben gehad. Nadien werd een bloedmonster afgenomen voor verdere analyse. Uit dit materiaal willen we membraanblaasjes isoleren om deze vervolgens ook te analyseren met de eerder geoptimaliseerde methode. Hier willen we pimonidazole-labelling vergelijken met de aanwezigheid van veelgebruikte tumormarkers. Op deze manier hopen we vast te stellen of de pimonidazole gelabelde blaasjes van de tumor of van gezond weefsel afkomstig zijn.

Verwachte uitkomsten
In dit project verwachten we het volgende te bereiken:

• Het optimaliseren van een methode om individuele membraanblaasjes te analyseren voor pimonidazole en tumormarkers.
• Analyse van membraanblaasjes in bloedmonsters van een diermodel en patiënten voor pimonidazole en tumormarkers, met de associatie hiertussen in kaart gebracht.

Implementatie
Na het succesvol afronden van dit project, willen we het voorgestelde concept verder testen in een grotere groep patiënten. We willen daarbij analyseren of de gemeten pimonidazole-labelling in membraanblaasjes circulerend in het bloed correspondeert met de hoeveelheid hypoxie in tumormateriaal.